艾灸通過(guò)調(diào)節(jié)滑膜G蛋白偶聯(lián)受體43和輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎的研究

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA)是一種以進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞和高致殘率為特點(diǎn)慢性炎癥性疾病，并常伴有一系列關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，包括心血管疾病、肺部疾病、胃腸道疾病等，是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

艾灸作為傳統(tǒng)的外治方法，治療RA較為安全，幾乎無(wú)副作用，且具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，目前研究發(fā)現(xiàn)艾灸能夠通過(guò)輔助性T細(xì)胞17（helper T cell， Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell， Treg）平衡改善RA關(guān)節(jié)癥狀。

G蛋白偶聯(lián)受體43(g-protein-coupled receptor 43，GPR43)是一種重要的短鏈脂肪酸受體，在腸道、脂肪組織和免疫系統(tǒng)中均有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)食欲和胃腸道肽分泌以調(diào)節(jié)脂肪分解和形成。

研究表明，GPR43的新型變構(gòu)激動(dòng)劑能夠減輕炎癥，支持了其作為治療藥物對(duì)各種炎癥性疾病的臨床實(shí)用性，且GPR43能夠調(diào)節(jié)外周來(lái)源的Treg水平。

Treg和Th17與RA疾病活動(dòng)密切相關(guān)，Treg可通過(guò)分泌具有抗炎信號(hào)傳導(dǎo)特性的抑制性細(xì)胞因子來(lái)影響免疫耐受，降低炎性反應(yīng)，如白介素-10（Interleukin 10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）；而Th17細(xì)胞能夠分泌白介素-17（interleukin 17，IL-17)，引發(fā)滑膜的炎性反應(yīng)。

但目前艾灸是否能夠通過(guò)GPR43調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡并未得到驗(yàn)證，故本研究建立 AA 大鼠模型，觀察艾灸“足三里”“腎俞”對(duì) AA 大鼠滑膜組織GPR43相對(duì)表達(dá)量，外周血Th17/Treg，血清IL-10、TGF-β1水平的影響，探討艾灸治療RA的可能機(jī)制。

健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量（190~210）g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001]。

動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度為21~25 ℃、濕度為 40% ~60%，食用正規(guī)鼠用飼料及滅菌自來(lái)水。

適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只Wistar大鼠分為正常組、模型組、艾灸組，每8只。

本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：No.AHUCM-rats-2022139)，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的相關(guān)規(guī)定。

20%烏拉坦溶液（上海源葉），弗氏完全佐劑（CFA，美國(guó)Sigma），蘇木精染液、醇溶伊紅染液（安徽Ebiogo），乙級(jí)染色劑（德國(guó)Electron Microscopy Sciences），戊二醛、鋨酸（美國(guó)Ted Pella Inc），GAPDH（北京Zsbio），GPR43（英國(guó)Abcam），藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的分化決定簇抗原3 （CD3 ）、異硫氰酸（FITC）標(biāo)記的分化決定簇抗原4（CD4 ）、

別藻藍(lán)蛋白（APC）標(biāo)記的白介素-2受體α亞基（CD25 ）、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的叉頭框蛋白P3（FOXP3 ）、核內(nèi)染色套裝（美國(guó)Biolegend），IL-17A-APC（美國(guó)Thermo），大鼠IL-10、大鼠TGF-β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒（武漢基因美科技）。

YB-7LF生物組織包埋機(jī)（湖北亞光），ZT-12M生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北亞光），CX41顯微鏡（日本Olympus），JEM1400透射電鏡（日本電子），morada G3數(shù)碼相機(jī)記錄圖像（德國(guó)蒙斯特），pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器），自動(dòng)曝光儀（上海培清科技），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman），RT-6100酶標(biāo)儀（深圳雷杜），JW3021HR離心機(jī)（安徽嘉文），足容積測(cè)量裝置（20 mL的無(wú)活塞注射器和5 mL的完全注射器之間用一根膠管相連）。

模型組和艾灸組采用風(fēng)、寒、濕環(huán)境因素+ CFA注射的方法復(fù)制 AA 模型：將大鼠放置在自制造模箱內(nèi)，使箱內(nèi)溫度(6±2)℃，濕度80%~90%，風(fēng)力定于高檔，持續(xù)20 d(12 h/d，20:00-8:00)，第21天于大鼠右后足趾部注射CFA(0.5 mL/只)致炎。

觀察3 d，至24 h大鼠雙側(cè)足趾炎性腫脹和顏色改變，48 h后出現(xiàn)雙側(cè)肢體或前肢、耳、尾部炎性結(jié)節(jié)或紅腫，表明造模成功。

正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

模型復(fù)制后第7天，艾灸組進(jìn)行干預(yù)，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，大鼠剪去被毛，標(biāo)色后，將其放置在特制懸空木架上固定，用艾條（直徑 0.5 cm、長(zhǎng)度 20 cm，南陽(yáng)市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）距穴位2 cm處懸灸，依次灸雙側(cè)“足三里”“腎俞”，刺激20 min，1次/d，7 d為1個(gè)療程，共3個(gè)療程。

正常組和模型組只進(jìn)行相應(yīng)抓取固定，不做其他干預(yù)。

關(guān)節(jié)腫脹度（joint swelling degree，JSD）測(cè)量：分別于干預(yù)前 1 d和干預(yù)最后 1 d，采用自制排水法測(cè)量各組大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)折以下的足趾容積。

計(jì)算其足跖腫脹度：JSD（%）=（Vt-Vn）/Vn×100%（Vn、Vt分別代表致炎前后足跖容積）。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分：分別于干預(yù)前 1 d 和干預(yù)最后 1 d觀察并記錄。

按 5 級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)：所有關(guān)節(jié)均無(wú)紅腫，0分；小趾關(guān)節(jié)紅腫，1分；趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹，2分；踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹，3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，4分。

各關(guān)節(jié)積分求和即為大鼠的 AI 評(píng)分，總分為0 ~16分。

取材方法：干預(yù)結(jié)束后次日，每組取6只大鼠，腹腔注射20%烏拉坦溶液（0.5 mL/100 g）麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 mL，其中一部分用于流式細(xì)胞術(shù)，剩余部分離心20分鐘左右（2000~3 000 r/min）分離血清，用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)。

手術(shù)剪分離取出踝關(guān)節(jié)軟骨下附著的淡黃色光滑透亮的滑膜組織。

一部分供HE染色和透射電鏡觀察，其他液氮凍存用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

HE染色觀察滑膜組織形態(tài)變化：取出部分滑膜組織，放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片（厚度約4 μm），脫蠟、乙醇脫水。

蘇木素浸染2~5 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗，飽和碳酸鋰溶液藍(lán)化數(shù)秒，流水沖洗，乙醇脫水，伊紅染液浸染數(shù)秒，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，×400光學(xué)顯微鏡下觀察滑膜細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

透射電鏡觀察滑膜組織形態(tài)變化：取部分滑膜組織，2.5%戊二醛固定24 h，PBS緩沖液浸泡6 h，1%鋨酸固定2 h后常規(guī)脫水包埋，45 ℃烤箱12 h、72 ℃烤箱24 h，制成超薄切片（片厚70 nm），銅網(wǎng)撈片，電子染色。

JEM1400型透射電鏡觀察滑膜組織超微結(jié)構(gòu)。

Western blot法檢測(cè)滑膜組織中GPR43蛋白表達(dá)：取備用滑膜組織樣本（約0.1 g左右），加入RIPA細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱15分鐘，冷卻后，將樣品每孔加5~10 μL，恒壓80 V電泳，1 h。

轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗GPR43（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶20 000），室溫孵育1.2 h，再次洗膜后使用ECL發(fā)光試劑盒來(lái)檢測(cè)蛋白。

Image J軟件進(jìn)行條帶的分析。

以GAPDH作為內(nèi)參量，計(jì)算GPR43蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17和Treg百分比：腹主動(dòng)脈取全血，加入相應(yīng)的抗體，Th17(CD3，CD4)，Treg(CD4，CD25)，避光孵育15 min。

檢測(cè)Th17細(xì)胞加入固定劑和破膜劑后加入適量的IL-17A；檢測(cè)Treg細(xì)胞加入破核劑后加入適量的FOXP3，常溫避光20 min。

用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)lowJo_V10分析Th17和Treg百分比。

ELISA法檢測(cè)血清IL-10及TGF-β1水平：腹主動(dòng)脈取血，離心20分鐘左右（2 000~3000 r/min）分離血清。

嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)依次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品及樣品加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色等操作，于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算血清中IL-10、TGF-β1含量。

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad 8.0.1作圖。

采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示符合正態(tài)分布的數(shù)值變量資料，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)采用 LSD 法，方差不齊時(shí)則采用 Tamhanes T2 法。

以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

造模后與正常組相比，模型組和艾灸組大鼠JSD、AI評(píng)分均顯著升高（P＜0.01），治療后與模型組相比，艾灸組大鼠的JSD、AI評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。

采用HE染色和電鏡評(píng)價(jià)艾灸對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的影響。

正常組大鼠滑膜細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠滑膜細(xì)胞排列不整齊，增生活躍，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；艾灸組大鼠滑膜細(xì)胞略有增生，浸潤(rùn)炎細(xì)胞較模型組明顯減少。

正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中細(xì)胞核膜核膜光滑完整，核染色質(zhì)相對(duì)致密均勻，線(xiàn)粒體形態(tài)規(guī)整、嵴突可見(jiàn)；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中細(xì)胞核膜不清晰、不完整，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體腫脹、嵴被破壞；艾灸組滑膜細(xì)胞核膜較清晰光滑、核染色質(zhì)固縮不明顯，線(xiàn)粒體腫脹不顯著、嵴突可見(jiàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組AA大鼠滑膜組織中GPR43蛋白表達(dá)較正常組降低（P＜0.01）；艾灸組AA大鼠滑膜組織中GPR43蛋白表達(dá)較模型組升高，艾灸能夠提高AA大鼠滑膜組織中GPR43蛋白表達(dá)（P＜0.05）。

為了闡明艾灸對(duì)AA大鼠炎性反應(yīng)的影響，我們檢測(cè)了大鼠的血液指標(biāo)。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組AA大鼠外周血中Treg百分比降低，Th17百分比升高（P＜0.01）；與模型組比較，艾灸組AA大鼠外周血中Treg百分比升高，Th17百分比降低（P＜0.01）。

我們進(jìn)一步檢測(cè)了AA大鼠血清中IL-10、TGF-β1的水平。

數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠血清IL-10、TGF-β1含量較正常組降低（P＜0.01）；艾灸組大鼠干預(yù)后血清IL-10、TGF-β1含量較模型組升高（P＜0.01）。

滑膜組織GPR43表達(dá)與外周血Treg表達(dá)的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示滑膜組織GPR43相對(duì)表達(dá)量與外周血Treg百分比存在線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系（r=0.967，P＜0.01）。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）屬“痹證”范疇，與中醫(yī)古籍中所提到的“歷節(jié)”“鶴膝風(fēng)”等癥狀相似。

《素問(wèn)·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，認(rèn)為是風(fēng)寒濕邪是痹證的重要病因病機(jī)，這奠定了中醫(yī)治療痹癥的理論基礎(chǔ)，又有《中藏經(jīng)·論骨痹》：“骨痹者，乃嗜欲不節(jié)，損腎也”，《脾胃論》：“內(nèi)傷脾胃……為諸濕痹”，可見(jiàn)RA與脾胃腎關(guān)系密切。

故本研究所選穴位為“足三里”與“腎俞”，足三里是胃腑之下合穴，是與免疫系統(tǒng)相關(guān)的重要穴位，具有補(bǔ)益氣血、扶正祛邪的作用；腎俞則為腎經(jīng)經(jīng)脈之氣輸注于背部之處，可補(bǔ)腎納氣、強(qiáng)筋健骨。

研究表明，近年艾灸治療寒濕痹阻型RA常用的腧穴以溫陽(yáng)補(bǔ)腎、祛濕散寒為主，主要包括足三里、腎俞、阿是穴等。

且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾灸足三里、腎俞等穴位可調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)，改善骨破壞，從而減輕RA的患者臨床癥狀。

Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子是IL-17、IL-22，它們通過(guò)刺激抗菌肽和趨化因子的產(chǎn)生來(lái)吸引白細(xì)胞，引起自身免疫反應(yīng)。

Treg細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-10和TGF-β等抗炎細(xì)胞因子，抑制多種免疫細(xì)胞活性，從而發(fā)揮免疫抑制作用。

這兩種細(xì)胞在分化上相互抑制，在功能上相互拮抗，Th17細(xì)胞引起自身免疫，而Treg細(xì)胞抑制自身免疫，兩者共同維持機(jī)體免疫平衡，因此，Th17和Treg細(xì)胞的相互生成至關(guān)重要。

研究表明Treg在RA的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子（IL-10，TGF-β）抑制活化的免疫細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn) AA 模型組大鼠外周血Treg百分比較正常組降低，艾灸組AA大鼠外周血Treg百分比較模型組升高，這與以往的研究結(jié)果一致。

GPR43參與炎癥發(fā)生過(guò)程，是RA重要調(diào)節(jié)因子，它能夠降低IL-6、IL-8的表達(dá)，并呈劑量依賴(lài)性。

且GPR43被短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid， SCFAs)激活后，能夠使Treg增殖和抑制能力增強(qiáng)，包括產(chǎn)生IL - 10。

這些發(fā)現(xiàn)表明GPR43在調(diào)節(jié)RA發(fā)病機(jī)制方面具有重要的潛在能力。

本研究結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠JSD、AI評(píng)分、外周血Th17百分比升高，外周血Treg百分比、滑膜組織GPR43蛋白表達(dá)及血清IL-10、TGF-β1含量降低；與模型組相比，艾灸組大鼠JSD、AI 評(píng)分、外周血Th17百分比降低，外周血Treg百分比、滑膜組織GPR43蛋白表達(dá)及血清IL-10、TGF-β1含量升高，且滑膜組織GPR43相對(duì)表達(dá)量與外周血Treg百分比呈正相關(guān)關(guān)系。

綜上，艾灸“足三里”“腎俞”可能是通過(guò)GPR43調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1的分泌，從而改善 AA大鼠關(guān)節(jié)癥狀。

研究表明，SCFAs可能通過(guò)GPR43將信號(hào)傳輸給免疫細(xì)胞，促進(jìn)初始T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，發(fā)揮抗炎作用。

本研究亦觀察到AA大鼠GPR43的變化，因此艾灸是否通過(guò)影響SCFAs調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡發(fā)揮治療作用，還需進(jìn)一步綜合研究。

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